相信了解過一些化學研究的同學們都對“過柱子”這個詞并不陌生。所謂過柱子，其實是色譜法中的一種——柱層析。正好最近分析化學課程中學了相關知識，那就來給大家分類介紹一下色譜法，權當期末復習（
先放一個百度百科對于色譜法的總定義：“色譜法利用不同物質在不同相態(tài)的選擇性分配，以流動相對固定相中的混合物進行洗脫，混合物中不同的物質會以不同的速度沿固定相移動，最終達到分離的效果。”簡而言之，可以把流動相理解為動力來源，固定相理解為阻力來源，由于物質性質不同，在固定相的影響下通過柱子的時間不同，就能挨個分離檢測了。
其實色譜的分類方法有很多種，例如按照流動相和固定相的物態(tài)劃分：氣固色譜法，氣液色譜法，液固色譜法，液液色譜法 。這里把流動相的物態(tài)放在名字的前面，固定相放在后面。正常情況下固態(tài)物質是不可能作為流動相的，氣態(tài)物質也不會作為固定相，所以也不可能出現“固~色譜”“~氣色譜”。
也有按照固定相形式分類的，例如紙色譜（高中生物分離菠菜葉色素），薄層色譜，柱色譜。
本文要用的分類方法，是按照色譜法的原理進行分類介紹，方便大家對于色譜法有更深的了解。
1 吸附色譜法 Adsorption Chromatography：
吸附色譜法通常采用固態(tài)固定相，利用固態(tài)吸附劑對于通過物質不同程度的吸附來達到分離的效果。這里的吸附作用大多指分子間作用力，例如疏水作用力，芳環(huán)相互作用，較強的也會有一定的氫鍵作用，因此常常是和吸附劑及分析物質的極性密切相關的。極性相似的物質之間相互作用力就更強，所以與固定相極性越相似的物質，被吸附的時間更長，通過柱子的時間也就更長。通常情況下，流動相的極性和固定相是相反的，所以是最快通過的物質。
根據固定相極性的大小，通常把色譜分為正相色譜（固定相高極性，流動相低極性或者無極性）；反相色譜（固定相低極性或者無極性，流動相高極性）。需要注意的是，此處的正反相色譜盡依靠固定相和流動相的極性分類，和分離原理無關，所以正反相色譜不一定是吸附色譜或者下面要說的分配色譜。
在實驗課上，我們又做了一次菠菜葉色素的分類，但是這次用的是柱色譜。我們用的固定相是C18 結合在硅膠球上，具體結構如下：C18由于基本上全是烴基碳鏈，基本上是無極性的，所以對極性低的色素吸附能力較強，屬于反相色譜。
經過色譜分離后，我做出來的譜圖如下：
其中每一個峰就代表一個（或者多個極性相近的）色素。信號檢測是測的對于450nm波長光的吸收。橫軸是時間軸，越靠前峰代表極性越強的色素，最前面的峰是流動相（水，乙腈，乙酸乙酯混合物）
2 分配色譜法 Partitioning Chromatography：
說分配色譜法就不得不提大家的一個高中化學小實驗：萃取。利用溶質在兩種不混溶的溶劑中溶解度不同，將溶質集中到溶解度高的溶劑中。而分配色譜法就像是在通過柱子的過程中不斷進行微觀尺度上的萃取。在SP中溶解度高的溶質就會在SP中停留更長的時間，進而更遲通過柱子并被檢測到。
分配色譜法和吸附色譜法的主要區(qū)別在于固定相的物態(tài)，如果固定相是固態(tài)，就不存在什么溶解度的問題，只能通過吸附作用結合分析物。相反的，分配色譜的固定相的液態(tài)?？隙ㄓ腥藭婀?，這個液體你怎么固定，它不流下來嗎？其實分配色譜中液態(tài)的固定相是結合在固態(tài)物質上的，有可能是管壁，也有可能是填充的小顆粒。
3 離子交換法 Ion-exchange Chromatography:
離子交換色譜通常有著帶電荷的固定相，通常是帶有陽離子或者陰離子的樹脂等有機物。這些帶電荷的基團和一些電性想法的離子相結合，不同離子和固定相基底的親和性不同，進而做到離子的分離和交換。分析物在通過柱子的時候在不斷進行著離子結合與分離的平衡，最終結合能力更強的離子將會與固定相結合，結合能力弱的離子被洗脫下來。通常是電荷更高，水合半徑更小，極化能力越強的離子結合能力更強。我們用離子選擇性常數（ion selectivity）來表示結合能力，越高結合能力越強。
我們通常把離子交換色譜分為陽離子交換，陰離子交換和同時交換，下面分別舉例介紹：[SP]表示固定相的結合基團
陽離子交換：固定的有機陰離子，例如磺酸基、羧基等。原本的陰離子基團上會附著陽離子，被通過柱子的親和性更強的陽離子取代，原先附著的陽離子被洗脫。
([SP]Li+ + KCl-->[SP]K+ + LiCl)
陰離子交換：固定的有機樣離子，例如季銨鹽。原本的陽離子基團上會附著陰離子，被通過柱子的親和性更強的陰離子取代，原先附著的陽離子被洗脫。 ([SP]OH- + KI-->[SP]I- + KOH)
同時交換陰陽離子：用可成內鹽的兩性有機物作為基底，同時結合陰陽離子，相當于二合一的柱子。（[SP]Na+ and [SP]Cl- + LiI and KF-->NaF + LiCl + [SP]K+ and [SP]I-）
我們做離子交換色譜通常有兩種目的，一是替換現有分析物中的陽/陰離子為另一種同電性離子。這樣只需要替換的目的離子親和力低于原離子，過一下柱子就能得到目標產物。也可能是需要分離出分析物中的某個離子，這樣就需要將分析物中的離子先通過離子交換固定到柱子上，與有機的帶電基團結合，然后再進行洗脫。離子的洗脫通常通過調節(jié)pH并流過大量洗脫液，拖動平衡，洗下目標離子。
4 尺寸排阻法 Size Exclusion Chromatography：
顧名思義，尺寸排阻法的核心就是利用分子尺寸的不同對分子進行分離。這種方法使用的固定相多為含有很多小孔的凝膠，這些小孔的大小不一，對于能通過的分子尺度就有不同程度的篩選。在尺寸排除色譜中，如果一個分子足夠大，那它就不會通過任何小孔，而只能通過固定相之間的空隙，走最短的路程流出色譜柱，成為最先出現的峰。而極小的分子，還有流動相，都可以通過固定相凝膠所含的全部小孔，使其在流出色譜柱前走過了一條最為曲折的線路，顯現出最后的峰。
對于這種色譜的定量分析也非常有意思。由于流動相的流速是固定的，我們將出峰時間和物質通過的體積可以做一個線性對應。首先將色譜柱中除去固定相的所有體積稱為總體積Vt。在Vt中，對分子大小無篩選作用的填充空隙，稱為Vo。剩下的固定相小孔所占據的體積，稱為Vm。Vm+Vo=Vt。一個分子在通過色譜柱時，將會經過所有的Vo；而由于尺寸限制，則只會經過部分可通過的Vm。如果將一個分子經過的真正體積稱為Vr，我們可以定義出K：
對于足夠大的分子，K=0，對于無孔不入的小分子和流動相，K=1。通常情況下，K在0~1之間，但是如果分析物除了通過固定相的空隙和小孔以外，還和固定相產生了一定的吸附作用，進一步增長通過的時間，就可能出現K大于1的情況。
5 親和色譜法 Affinity Chromatography：
親和色譜法通常是色譜法中可以將選擇性做到最高的一種，對于單一物質的嚴格篩選非常實用。在很多生物實驗中，親和色譜法利用的是酶和底物，或者抗體抗原的特異性結合。將這種特異性結合的一方作為固定相，從而在混合物中分離純化出另一方。在我們的實驗課上，我們使用的固定相是Ni-NTA瓊脂凝膠，用來分離基因編譯大腸桿菌合成的帶有單一組氨酸殘基區(qū)域的蛋白質，利用的是連續(xù)的組氨酸殘基對鎳原子的螯合結合。
對于親和色譜還有一個很有意思的部分就是洗脫，即目標產物和固定相結合后收獲產物的步驟。首先我們通常會用一定量的清洗液進一步純化分析柱中的物質，保證其中只剩下結合在固定相上的目標產物。接下來會用特殊的洗脫液解開目標產物和固定相之間的結合，通常的做法有改變pH、取代等。例如我們所做的對于上述蛋白的洗脫，是用含有較高濃度咪唑的緩沖溶液，替換掉連續(xù)組氨酸殘基對于鎳原子的螯合。隨著咪唑對蛋白的取代，蛋白就會隨之洗脫液流出分析柱。
總結：
本文按照不同原理，對于各種色譜方法進行了簡要的介紹，方便大家再今后接觸到的時候，至少對于實驗在干什么有個基本的概念。色譜法的理論和具體運用遠比文章中所展現的要紛繁復雜的多，有興趣可以進一步深入了解。
參考文獻：（分析化學課的教科書）
(1) Harris, D. C. Quantitive Chemical Analysis, ninth edit.; 2016.
